Séchage méthodes Protocole pour le PVDF

Lors de la liaison des acides nucléiques ou des protéines , un matériau high- contraignant appelé PVDF ( difluoropolyvinyl ) membrane fournit un support pour les anticorps . Par Western blotting , les membranes sont empilées ensemble , préparés à l’anticorps , puis on les sèche. Protocole pour le séchage de la membrane nécessite la connaissance de la façon dont fonctionnent les membranes , plaques de cathode , plaques d’anode et l’application de solutions de méthanol . Avec le protocole approprié , la membrane se lie en toute sécurité avec l’anticorps spécifique et est prêt à l’emploi ou le stockage immédiat . Préparation de la membrane

Préparation de la membrane de PVDF nettoie et stabilise la membrane avant le transfert . Avant le séchage , la membrane est  » bloqué  » pour empêcher la liaison de l’autre que les acides nucléiques spécifiques, tels que des anticorps non spécifiques rien. Au cours de cette procédure , vous mouillez la membrane en le posant sur une surface plane recouverte de méthanol . La membrane change de couleur au cours de cette phrase , de l’opaque au translucide . Une fois terminé avec le bain de methanol , la membrane est placée dans de l’eau désionisée à tremper pendant environ deux minutes. La membrane doit ensuite tremper à nouveau dans une solution de méthanol qui est très acide .
Assemblée des membranes avant le transfert

Deux des articles de la membrane sont trempées dans la première solution de méthanol et placée sur une plaque d’anode . Au cours de ce processus , vous devez vérifier soigneusement les bulles d’air piégées , ce qui pourrait compromettre le transfert . Un autre morceau de papier filtre est trempée dans la seconde solution de methanol et placée sur le dessus de la pile. Un gel va alors au-dessus de la membrane , avec soin de ne pas piéger les bulles d’air entre l’ application du gel et de la membrane . Trois nouveaux morceaux de papier sont ensuite trempés dans un tampon de cathode et placés sur le dessus du gel . Si toute bulles d’air se produit , un tube à essai fonctionne pour lisser les membranes .

Transfert

Dans cette partie du processus , vous vous connectez à haute tension cordes à une source d’alimentation et appliquer un courant constant à la surface du gel sur la membrane pendant 30 minutes . Les temps de transfert varie en fonction du type d’anticorps . Après 30 minutes , vous supprimez l’alimentation et de la membrane de transfert . Le coin inférieur droit de la membrane est ensuite coupé pour vérifier l’orientation . Les deux premières couches de papier filtre sont mis au rebut , y compris le gel . Les bandes de poids moléculaire sont marqués avec un stylo à bille.
Séchage

Une fois le transfert terminé , vous séchez la membrane dans l’une des deux façons . Pour accélérer le séchage , la membrane est trempée dans 100 pour cent de methanol pendant 10 secondes pour éliminer toute l’eau . La membrane repose alors sur un morceau de serviette en papier pendant 15 minutes . Pour un procédé de séchage plus lent , la membrane est placée sur la serviette en papier sans addition de méthanol . Une fois séchée , la membrane peut être utilisé ou stocké dans un récipient sec à 4 degrés Celsius pour une utilisation future .